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产品详情
操作说明
注意事项
产品简介
目前最常用的蛋白浓度定量检测方法有两种，即Bradford法和BCA法。Bradford法原理是基于考马斯亮蓝G250能与蛋白质快速结合。考马斯亮蓝G250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488 nm，其与蛋白质结合后在595 nm处有最大吸收值，并且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量检测。本方法测定蛋白浓度不受绝大部分样品中的化学物质的影响，样品中β-巯基乙醇的浓度可高达1 mM，二硫苏糖醇的浓度可高达5 mM；但受略高浓度的去垢剂影响，需确保SDS含量低于0.01%，Triton X-100含量低于0.05%，Tween-20，Tween-60，Tween-80等含量低于0.015%。含去垢剂的样品推荐使用本公司生产的BCA蛋白浓度测定试剂盒。
本试剂盒操作简便快捷，灵敏度高，检测速度极快，可检测蛋白浓度范围为25-1000μg/mL。
储存与运输
整套试剂可常温运输；蛋白标准品（BSA）4℃保存，有效期12个月。配制成蛋白标准溶液后需-20℃保存，并在6个月内使用。
操作步骤
1. 配制蛋白标准贮备液：取1 mL蛋白标准配制液加入到蛋白标准品（BSA）管中，将25 mg蛋白标准品完全溶解，即得到浓度为25 mg/mL的蛋白标准贮备液。配制成的蛋白标准溶液可-20℃长期保存。
2. 配制蛋白标准工作液：取适量25 mg/mL蛋白标准贮备液，用PBS或生理盐水稀释50倍，得到终浓度为0.5 mg/mL的蛋白标准工作液。注意稀释时按照10倍梯度方法稀释，确保稀释准确。
3. 绘制标准曲线（酶标仪法）：将蛋白标准工作液分别按0，1，2，4，8，12，16，20 μL加到96孔板中，然后用PBS或生理盐水依次加20，19，18，16，12，8，4，0 μL将上述梯度工作液补足到20 μL。得到蛋白浓度依次为0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲线。
4. 准备待测样品：将待测的蛋白样品进行适当稀释（可通过预实验检测，使样品蛋白浓度在标准曲线范围内，确保检测结果可信），按照每个样品20 μL的量加到96孔板中。待测样品与蛋白标准品用相同溶液稀释。
5. 检测：向以上每孔加入200 μL考马斯亮蓝G250溶液充分混匀（可将96孔板放在振荡器上振荡30 s），室温放置3-5 min后，以标准曲线0号做参比，在595 nm波长下比色测定，记录各孔吸光度值。
6. 计算：以标准曲线中梯度蛋白含量（μg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘出标准曲线。根据所测样品的吸光值，在标准曲线上即可查得相应孔中待测样品的蛋白浓度（μg/mL），再乘以样品稀释倍数即为待测样品实际蛋白浓度。
另：如用分光光度计测定，则在第3步中将梯度标准品反应体积改为1 mL。向7支洁净的玻璃试管或比色管中分别加入0，0.05，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL蛋白标准工作液（浓度0.5 mg/mL），然后各管中依次分别加入PBS或生理盐水1.0，0.95，0.9，0.8，0.6，0.4，0.2，0 mL，将梯度工作液补足至1 mL，每管充分混匀，即得到蛋白浓度依次为0，25，50，100，200，300，400，500 μg/mL的梯度曲线。
待测蛋白样品做适当稀释后，加入到新的玻璃试管或比色管中，样品量为1 mL。
向上述标准曲线梯度管及样品管中各加入考马斯亮蓝G250溶液3 mL，充分混匀，室温静置3-5 min后用分光光度计进行比色检测。
检测时分光光度计波长设置595 nm，以标准曲线0号管为参比调零，检测标准曲线及待测样品。按照步骤6中的方法绘制标准曲线及计算待测样品中的蛋白浓度。
注意事项
1. 考马斯亮蓝G250溶液使用前需恢复至室温，并颠倒混匀，以免影响检测的灵敏度。
2. 在进行蛋白标准贮备液的配制时，需确保溶解充分。稀释配制蛋白标准工作液时建议10倍梯度稀释，不要一次稀释50倍，以免产生较大误差。
3. 操作时请穿实验服，并佩戴一次性手套。
产品仅供科研用途，不用于临床诊断！
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