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衰老细胞β-半乳糖苷酶染色试剂盒

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货号:
KB210467
产品规格:
100T
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产品详情 操作说明 注意事项

产品简介

绝大多数正常细胞的分裂能力是有限的,在不能分裂后就进入衰老状态,此过程即为细胞衰老(cell senescence),细胞衰老是细胞控制其生长潜能的保障机制,一般含义是复制型衰老(replicative senescence)。正常细胞经过有限次数的分裂后停止分裂,出现不可逆的生长停滞,此时细胞仍然是存活的,但是细胞形态和生理代谢活性发生明显变化,通常表现为细胞体积变大,与衰老相关的β-半乳糖苷酶为活化状态。β-半乳糖苷酶是细胞溶酶体内的水解酶,通常在pH 4.0时表现活性,但在衰老细胞内该酶在pH 6.0条件下表现活性。本试剂盒即是基于此现象及原理,针对衰老相关β-半乳糖苷酶活性水平上调而对衰老组织或细胞进行染色。具体反应原理就是以X-Gal为底物,衰老细胞特异性β-半乳糖苷酶催化该底物生成蓝色产物,表现为细胞胞质有蓝色沉积物,可以在光学显微镜下进行观察。按照每个样品染色液用量为1 mL计算,本试剂盒可完成100个样品的染色。


储存与运输

冰袋(wet ice)运输;4℃避光保存,有效期12个月。其中X-Gal粉末如果配制成溶液后分装成小份-20℃保存,3个月内有效。



使用方法

l 试剂准备

1. 自备PBS缓冲液。

2. 将100 mg X-Gal粉末用5 mL DMF(二甲基甲酰胺)充分溶解混匀,分装至1.5 mL洁净离心管中,每管0.5 mL,-20℃避光保存。避免反复冻融。

3. 按照下表比例配制β-半乳糖苷酶染色工作液。如果是6孔板培养的细胞,每孔需要1.0-1.5 mL染色工作液,如果是12孔板,每孔需要0.5-1.0 mL染色工作液。根据样本量配制染色液,避免浪费。

Component

Volume

β-半乳糖苷酶染色液A

940 μL

β-半乳糖苷酶染色液B

10 μL

X-Gal溶液

50 μL

总体积

1 mL

 

l 染色步骤

1. 对于贴壁细胞

(1) 6孔板培养好的细胞(或细胞爬片),吸除细胞培养液,用PBS洗涤2次,加入1 mL β-半乳糖苷酶染色固定液,室温固定15 min。

(2) 弃去固定液,用PBS洗涤细胞3次,每次2 min。

(3) 用移液器将PBS 吸除干净,每孔加入1 mL β-半乳糖苷酶染色工作液,置于37℃孵育2 h至过夜。注意:不能在37℃二氧化碳培养箱中孵育。染色期间需及时观察显色情况,如果样本中β-半乳糖苷酶表达量较高,在数小时内即可完成染色。如果β-半乳糖苷酶表达量低,则需适当延长孵育时间,期间需用保鲜膜或parafilm封住6孔板,防止液体蒸发影响染色结果。

(4) 普通光学显微镜下观察,阳性细胞显色后,去除染色工作液。如果需要复染细胞核,向孔板内加入少量核固红染液覆盖细胞室温染色3 min,去除染色液,用PBS清洗数次。

(5) 加入2 mL PBS覆盖细胞,至此染色完成,此样本可于4℃保存1周。或者加入70%甘油覆盖细胞,4℃可保存较长时间。如果是细胞爬片,则可将爬片充分烤干,二甲苯透明后滴加中性树胶封片,可长期保存。

2. 对于冰冻切片

(1) 冰冻切片室温复温10 min。以组化笔画圈,将组织圈出。

(2) 向组织上滴加适量β-半乳糖苷酶染色固定液,以完全覆盖住组织为宜,室温固定20 min。

(3) 组织切片经PBS浸泡洗涤3次,每次5 min。

(4) 将切片置于避光湿盒中,向组织上滴加适量β-半乳糖苷酶染色工作液,需完全覆盖住组织。湿盒放入37℃孵育,每隔2 h显微镜下观察显色情况,如果未见显色,则继续孵育,直到组织上衰老细胞显色。如果样本需过夜孵育,则需滴加足量的β-半乳糖苷酶染色工作液,防止染液蒸发干片。

(5) 待组织显色后,去除染色液,切片入PBS浸洗2次,纯水浸洗2次。

(6) (可选)滴加核固红染液染色3 min,水洗3次。

(7) 切片无水乙醇脱水2次,每次5 min再经二甲苯透明5 min,滴加中性树胶封片。

3. 染色结果

衰老细胞胞质内呈散在分布的蓝色。


注意事项

1. X-Gal溶液需室温完全解冻混匀后再使用。

2. β-半乳糖苷酶染色液A和B需提前恢复至室温后再使用,配制好的染色工作液需充分混匀无沉淀方可使用。

3. 衰老细胞β-半乳糖苷酶染色反应依赖于特定的pH条件,不能在CO2培养箱中进行孵育显色,否则会影响染色工作液的pH,导致染色失败。

4. 配制染色工作液时请选择聚丙烯(PP)或玻璃材质的耗材,不能用聚苯乙烯(PS)材质的耗材。

5. 在显色2 h-过夜期间需多次观察显色情况,时间过短可能导致阴性结果;时间太长则可能导致假阳性。显色时间与样本本身所含的β-半乳糖苷酶量多少有密切关系。

6. 在配制染色工作液前,需检查染色液A的pH值,如果不是6.0(可能因保存条件导致pH发生改变),需用HCl或NaOH调节pH至6.0再使用。

7. 组织切片的β-半乳糖苷酶染色,对于样本的前期准备要求较高,样本需-80℃保存,并尽快完成检测。因为β-半乳糖苷酶非常容易失活,样本保存不当或时间过久,都可能导致酶失活,则染色时没有阳性。

8. 操作时请穿实验服,佩戴一次性手套。

本产品仅供科研用途,不用于临床诊断!

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