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2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix

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货号:
SJ21575
产品规格:
15X1ml
购买数量:
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产品详情 操作说明 注意事项

产品简介

本产品是使用SYBR Green I嵌合荧光法进行qPCR反应的专用2×预混液。核心组分Taq DNA Polymerase是基于抗体法封闭的热启动DNA聚合酶,能有效抑制低温条件下的非特异性扩增,同时配以针对qPCR优化的反应Buffer,非常适合进行高特异性、高灵敏度的qPCR反应,可以在宽广的定量区域内得到良好的标准曲线,对靶基因定量准确、重复性好、可信度高。同时本品中含有特殊的ROX Passive Reference Dye,适用于所有qPCR仪器,无需在不同的仪器上调整ROX浓度。预混液中添加有蓝色染料,具有加样示踪作用,同时配套提供黄色模板稀释液,当用黄色模板稀释液稀释模板,并将其加入到蓝色反应预混液中,颜色由蓝色变为绿色,能够对配制反应体系过程起到示踪作用,防止漏加或错加。该蓝色与黄色染料的光谱与qPCR染料不重叠,不影响反应结果。


储存与运输

冰袋(wet ice)运输;-20℃避光保存,有效期12个月。


组成

Component Number

Component

G3326-01

G3326-05

G3326-15

G3326-1

2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix

1 mL

5×1 mL

15×1 mL

G3326-2

40×Yellow Template Dilution Buffer

1 mL

1 mL

1 mL

说明书

1份


操作步骤

1. (可选)模板稀释

本试剂盒中提供40×Yellow Template Dilution Buffer,即为40倍浓缩的黄色模板稀释液,可用于模板稀释,并通过液体颜色改变准确判断模板是否已经加入到qPCR反应液中。

以20 μL qPCR反应体系为例,根据加入到20 μL qPCR反应液中稀释后的模板量,对应原始模板稀释方法可参考下表(以原始模板稀释至100 μL为例):

稀释后的模板

加入到20 μLqPCR反应液中的体积(μL)

1

2

3

4

5

6

7

8

100 μL模板稀释体系中加入

40×Yellow Template Dilution Buffer的体积(μL)

50

25

16.7

12.5

10

8.4

7.2

6.3

原始模板加入到

100 μL模板稀释体系中的体积(μL)

x

x

x

x

x

x

x

x

补加Nuclease-Free Water的体积(μL)

50-x

75-x

83.3-x

87.5-x

90-x

91.6-x

92.8-x

93.7-x

例:若20 μL qPCR反应体系中加稀释后模板2 μL以100 μL模板稀释体系为例,当加入原始模板体积x为20 μL时,需加入25 μL40×Yellow Template Dilution Buffer,补加Nuclease-Free Water 55 μL至总体积100 μL此时稀释后模板中40×Yellow Template Dilution Buffer为10×取2 μL此稀释后的模板加入到20 μL反应体系中,最终40×Yellow Template Dilution Buffer即为1×。总之,需保证在最终的qPCR体系中Yellow Template Dilution Buffer

注:如模板无需稀释,或不使用G3326-2模板稀释液可忽略此步骤。

2. 推荐qPCR反应体系:

Component

20 μL rxn

50 μL rxn

Final Concentration

2×Universal Blue SYBR Green qPCR Master Mix

10 μL

25 μL

Forward Primer (10 μM)a

0.4 μL

1 μL

0.2 μM

Reverse Primer (10 μM)a

0.4 μL

1 μL

0.2 μM

Templateb

Variable

Variable

as required

Nuclease-Free Water

Add to 20 μL

Add to 50 μL


a.通常引物终浓度为0.2 μM可以得到较好扩增效果。反应性能较差时,可以在0.2-1.0 μM范围内调整引物浓度。

b.模板添加量因模板溶液中存在的靶基因的拷贝数不同而不同,进行梯度稀释研讨适当的模板添加量。在20 μL反应体系中模板DNA添加量最好在100 ng以下。以RT-PCR反应的cDNA(RT 反应液)为模板时,添加量不要超过PCR反应液总体积的10%。

3. PCR反应程序(可根据机型适当调整):

A. 两步法

B. 三步法

阶段

步骤

循环数

温度

时间

阶段

步骤

循环数

温度

时间

Stage 1

预变性

1

95℃

30 sec

Stage 1

预变性

1

95℃

30 sec

Stage 2

变性

40


95℃


15 sec

Stage 2

变性

40

95℃

15 sec

退火/延伸

60℃

30 seca

退火

55-65℃

10 sec




延伸

72℃

30 seca

Stage 3

熔解曲线

1

仪器默认设置

Stage 3

熔解曲线

1

仪器默认设置

a:若需提高扩增特异性,可使用两步法程序或提高退火温度;需提高扩增效率,可使用三步法程序或延长延伸时间。


注意事项

1. 如不需要进行移液追踪,则不使用40×Yellow Template Dilution Buffer进行模板稀释。

2. 试剂使用前请上下轻轻颠倒混匀,请勿涡旋振荡混匀,避免产生气泡。

3. 配制反应液时,试剂请于冰上放置。

4. 本制品中含有荧光染料SYBR Green,配制PCR反应液时应避免强光照射。

5. 反应液的配制、分装请使用新的一次性枪头,尽量避免样品间的交叉污染。

6. 避免反复冻融Master Mix,解冻后后尽量在一个月内使用完毕。


适配机型

ABI: 5700, 7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™, 7500/7500 Fast, ViiA 7™, QuantStudio™ 系列, PikoRealTM Cycler;

Stratagene: Mx3000P®, 3005P™, 4000™;

Bio-Rad: CFX96™, CFX384™, iCycler iQ™, iQ5™, MyiQ™, MiniOpticon™, Opticon®, Opticon 2, Chromo4™;

Eppendorf: Realplex 2s, Mastercycler® ep, realplex;

IIIumina: Eco QPCR;

Cepheid: SmartCycler®;

Qiagen Corbett: Rotor-Gene® 系列;

Roche: LightCycler™ 系列;

Takara: Thermal Cycler Dice系列;

Analytikjena: qTOWER系列;

qTOWER: LineGene系列。


引物设计原则

1. 扩增产物长度建议控制在80-300 bp之间;

2. 引物长度:18-25 bp;

3. 引物中碱基G+C含量应在40%-60%之间;

4. 正向引物和反向引物的Tm值相差不超过2℃为佳,Tm值控制在58-62℃为佳;

5. 碱基分布的随机性;

6. 引物最好不要含有自身互补序列,否则会形成发夹二级结构;

7. 两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基,不然会形成引物二聚体,尤应避免3'端的互补重叠;

8. 建议引物的3'末端碱基为G或C;

9. NCBI上的比对结果无其他非特异性产物出现。


常见问题及解决方法


问题描述

可能原因

解决办法

反应结束无扩增曲线出现或者Ct值出现过晚

模板浓度过低

减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起。

模板降解

重新制备模板,重复实验。

体系中存在PCR抑制剂

一般为模板带入,加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验。

引物可能降解

长期未用的引物,应先通过PAGE电泳检测完整性,以排除其降解的可能。

扩增效率低

提高引物浓度,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物。

扩增产物过长

扩增产物长度控制在80-300 bp。

空白对照出现信号

反应体系污染

首先更换空白对照的水,如果还发生同样情况,继续更换引物、吸头、PCR管或启用新的Master Mix;

反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染。

出现引物二聚体等非特异性扩增

一般在35循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况,应配合熔解曲线进行分析;

重新设计引物,调整引物浓度或优化PCR反应程序。

熔解曲线出现多峰

引物设计不佳

根据引物设计原则重新设计新引物。

引物浓度过高

适当降低引物浓度。

cDNA模板存在基因组污染

提取后的RNA溶液使用DNA酶进行消化,例如:dsDNase,以去除基因组污染,或设计跨内含子引物。

实验重复性差

加样误差大

使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液;

高倍稀释模板,加入大体积模板减少加样误差;

放大qPCR反应体积。

模板浓度过低

减少模板稀释倍数重复实验。

qPCR仪不同位置的温度偏差

定期校准qPCR仪。

扩增曲线不光滑

荧光信号太弱,经系统校正后产生

确保Master Mix中预混的染料未降解;

更换荧光信号收集更好的qPCR专用耗材。

扩增曲线断裂或下滑

模板浓度较高,基线的终点值大于Ct值

减小基线终点(Ct值-3),重新分析数据。

个别孔扩增曲线突然骤降

反应管内留有气泡

确保Mix完全溶解,请勿涡旋振荡混匀;

加样完成后轻弹离心去除气泡;

延长预变性时间至10 min,以去除气泡。

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